Tecnología CRISPR/Cas9

Edición de genes: una realidad, también en Paraguay

CRISPR es una técnica con la que se puede cortar y pegar secuencias de ADN, a fin de corregirlas. Es una adaptación de las herramientas que utilizan algunas bacterias al ser infectadas por los virus para defenderse del siguiente ataque de los mismos. Es aplicada en la medicina, la industria farmacéutica, la biotecnología, etc. Considerada sencilla, barata y muy precisa y, sobre todo, un significativo avance en la biomedicina, también tiene cuestionamientos éticos.

Cuando a principios de los 90’s, Francisco Juan Martínez Mojica (Francis Mojica), un microbiólogo español, publica el resultado de sus investigaciones acerca del sistema de defensa de unos microorganismos (arqueas) de las salinas de Santa Pola (Alicante, España) para evitar el ataque de ciertos virus (bacteriófagos), no se imaginaba que estaba dando los primeros pasos para la edición genética. Había identificado que dichas arqueas poseían un sistema de almacenamiento de información sobre los atacantes y que las utilizaban (recordaban) para cortar una parte del ADN viral y, así, defenderse cuando eran atacadas la siguiente vez. Una década después, las investigadoras Emmanuelle Charpentier (francesa) y Jennifer Doudna (estadounidense), ambas de la Universidad de California en Berkeley, demostraron la factibilidad de utilizar CRISPR para editar in vitro cualquier cadena de ADN, mediante la proteína Cas9. De ahí, la denominación CRISPR/Cas 9.

Análisis mediante electroforesis en gel de agarosa de los vectores CRISPR (derivados del pSpCas9 puro)

Conversamos con Dora B. Krimer, Investigadora del Centro de Investigaciones Biológicas del Consejo Superior de Investigaciones Científicas - CSIC, España, se encuentra en nuestro país para impartir una serie de cursos, uno de ellos, sobre CRISPR/Cas9, en el marco de los Proyectos 14-POS-007 y PINV15-573 de PROCIENCIA Conacyt.

Acceder a curriculum: https://cv.conacyt.gov.py/publicar/cv?id=ae04d173de22556b2b511113b9e77aca

Sitio web: http://cib.csic.es/es/departamentos/biologia-celular-y-molecular/biologia-molecular-de-los-cromosomas

¿En qué consiste la edición genética?

La edición genética es una forma de manipular los genes, realizando cambios en la secuencia de ADN: se puede cortar y eliminar fragmentos específicos, modificar e introducir nuevas secuencias, eliminar mutaciones y reemplazar por la secuencia correcta, etc. La tecnología CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular que se utiliza justamente para editar el genoma de cualquier célula. En mi laboratorio, por ejemplo, utilizamos CRISPR como una herramienta molecular para editar genes que se activan en células eritroleucémicas de ratón.

CRISPR ha sido una revolución en el campo de la Biología Molecular. La edición de genes ha sido un objetivo de los investigadores desde hace muchísimos años. Sin embargo, las tecnologías que se utilizaban antes del descubrimiento de CRISPR eran muy complejas, a veces muy caras, que implicaban experimentos muy largos y cuyos resultados muy a menudo producían “falsos positivos”.

Desde el año 2012, cuando se publicaron resultados que probaban que esta tecnología se podía aplicar a la edición genética de cualquier molécula de ADN, se ha desatado una verdadera revolución. Tal es así que, en el 2015, dos de las más prestigiosas revistas científicas, “Science” y “Nature” proclamaron a CRISPR como “el evento del año”. Pero este fenómeno trascendió más allá de la comunidad científica, fue noticia en medios de comunicación importantes como el “New York Times”, “El País, incluso en medios económicos como el “Wall Street Journal”, lo cual indica que, además, CRISPR es un fenómeno que tiene un potencial económico importante.

Dra. Dora B. Krimer, investigadora del CSIC

A partir de ese momento, el interés por CRISPR no deja de crecer. Si se compara por ejemplo el número de publicaciones científicas en donde se ha utilizado la herramienta CRISPR a partir del año 2012, se puede observar un crecimiento exponencial continuado.

Habla de CRISPR como una herramienta, pero, ¿qué es?

CRISPR, es un acrónimo de “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”, cuya traducción al español es: “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas”, y corresponde al sistema que utilizan las bacterias y los organismos muy primitivos como sistemas inmunológicos.

Esto se descubrió alrededor del año 93 por un microbiólogo español, Francis Mojica, quien estaba estudiando cómo se adaptaban las arqueas, unos organismos semejantes a las bacterias, a un medio tan agresivo como eran las salinas de su tierra natal en la provincia de Alicante.

De estudiar arqueas en unas salinas a la edición de genes.

Y entonces, estudiando el genoma de estas arqueas, vio que había unas secuencias o unas  “letras” en el genoma, que se repetían varias veces y que eran palíndromes (que se leían igual de derecha a izquierda, que de izquierda a derecha). Entre estas repeticiones, había otras secuencias, otros segmentos de ADN distintos en cada caso. Este fenómeno había sido observado previamente por científicos japoneses en el año 87, pero sin poder interpretar el significado de estas repeticiones.

Para Francis Mojica fue problemático obtener financiación para seguir investigando en este problema, ya los organismos financiadores eran escépticos en cuanto a la importancia del fenómeno o a una posible aplicación útil. No obstante, continuó. Vio que aquellas repeticiones no solamente estaban en las arqueas que él estudiaba, sino que también estaban presentes en todo tipo de bacterias y en sus plásmidos, que corresponden a círculos pequeños que poseen las bacterias y que crecen independientemente del ADN cromosómico.

Mojica intuyó que esto tenía algún sentido, que era un evento importante. Utilizando herramientas de bioinformática y buceando en las bases de datos descubrió que las secuencias que observaba entre las repeticiones correspondían a segmentos de ADN de virus que infectaban a las bacterias – que se denominan bacteriófagos-. Más adelante, Mojica y otros investigadores de distintos laboratorios determinaron el mecanismo de actuación de CRISPR. Cuando los virus infectan una bacteria, esta, a través de una proteína, una endonucleasa que denominada “Cas”, recoge un pequeño segmento del ADN del virus y lo almacena, como si le sacara una fotografía, y lo guardara en un álbum. Cuando un virus similar infecta una segunda vez a la bacteria, ésta recuerda que ha sido infectada, y envía otra proteína “Cas” para atacar al organismo invasor. En definitiva, las endonucleasas CRISPR actúan como unas tijeras moleculares cortando el ADN del virus y destruyéndolo. Y se puede decir que este proceso es el sistema inmunológico de las bacterias.

El sistema CRISPR/Cas9

Unos años después, dos investigadoras Jennifer Doudna de la Universidad de California, Berkeley y Enmanuel Charpentier de la Universidad de Umea, Suecia, coincidieron en un congreso de la Sociedad Americana de Microbiología que se celebraba en Puerto Rico en 2011. Decidieron, entonces, unir fuerzas e investigar el potencial del sistema CRISPR. En definitiva, pudieron diseñar un sistema basado en CRISPR/Cas9 que, “in vitro” (en el tubo de ensayo), podía cortar y editar ADN de cualquier organismo. Unos años después, Feng Zhang, del MIT y otros investigadores, comprobaron y aplicaron la tecnología a células humanas y de ratón.

Entonces, ya tenemos la herramienta perfecta para editar los genes, que es simple, se puede hacer en un laboratorio sencillo, (la Prof. María José Fernández, Líder del Grupo de Bioinformática de la Facultad Politécnica UNA está llevando a cabo, actualmente, experimentos con CRISPR); no necesita grandes equipos, es económico, muy preciso y que, en poco tiempo, es posible obtener resultados.

Curso "Modificación de la secuencia genética de la línea Parental MEL-DS19. Clase práctica (abril 2019)

¿En qué casos se utiliza?

Se puede utilizar en cualquier organismo. Se ha utilizado ya en células en cultivo de distinto origen, en todo tipo de modelos animales: ratón, mosca, gusano, plantas, etc. Es especialmente útil en la generación de ratones transgénicos. Esta clase de experimentos en la era pre-CRISPR eran sumamente complejos y requerían más de un año de trabajo como media. La utilización de CRISPR ha acortado este tiempo a un par de meses, aproximadamente.  

¿Para qué sirven estos ratones? Pueden ser modelos de enfermedades humanas, en donde es posible anular la actividad de un gen y observar sus efectos. Esto puede ser la base para descubrir dianas potenciales de fármacos para curar varios tipos de enfermedades. En la actualidad, se están llevando a cabo varios ensayos clínicos de enfermedades como la beta talasemia*, algunos tipos de cáncer como melanomas, sarcomas, mielomas que se pueden trabajar ex vivo, modificar el genoma en las células y, luego, trasplantarlos al paciente. Además de estos ejemplos que se enmarcan dentro de la Biomedicina, la tecnología CRISPR tiene un potencial enorme en Biotecnología, en Agricultura, en Biología Sintética…en fin… las aplicaciones futuras son innumerables.

*enfermedad hereditaria que reduce la producción de glóbulos rojos sanos.

En cuanto a los cuestionamientos éticos sobre el uso de esta herramienta en los seres humanos, ¿qué nos puede decir?

Recientemente, ha habido un caso en China, en donde se ha revelado la modificación de embriones humanos utilizando la tecnología CRISPR, y la comunidad científica ha reaccionado unánimemente condenando este proyecto. ¿Por qué? Porque, a pesar de ser una herramienta muy precisa y tener todas las condiciones que ya había mencionado, estamos aún muy lejos de poder emplearla en humanos. En este momento, estas herramientas todavía no son utilizables y no sé, creo que, en un futuro próximo, esto no va a ocurrir.

"... a pesar de ser una herramienta muy precisa y tener todas las condiciones que ya había mencionado, estamos aún muy lejos de poder emplearla en humanos".

Sobre el curso que vino a dar a la FP-UNA.

Me centré en CRISPR, en una de las charlas, en todo esto que le estoy contando: la metodología CRISPR, por qué es importante, un poco ahondando más en el funcionamiento y algo más a nivel molecular. También me referí al objetivo de la investigación que nosotros hacemos en el laboratorio y que hace también la Dra. Fernández, con quien nosotros colaboramos.

Desde hace muchísimos años, mi interés y el de la Dra. María José, también -que, de hecho, hizo la tesis en nuestro laboratorio- es estudiar la diferenciación celular en mamíferos. La pregunta que nos hacemos es: “¿por qué una célula se diferencia?”.

Me interesa fundamentalmente la biología molecular básica, pero es cierto que, también, tiene una repercusión en Biomedicina. Las células tumorales, un cáncer, son células que han perdido la capacidad de diferenciarse y que se reproducen de forma anormal. Entonces, si podemos contestar a la pregunta: “¿por qué una célula se diferencia?”, podremos intervenir en el proceso y evitar o corregir las anormalidades de las células tumorales. Para estudiar estos procesos, tenemos un modelo que se basa en células eritroleucémicas murina en cultivo. Estas células derivan de células de ratón que han sido infectadas con un complejo vírico principal responsable de que las células hayan perdido la capacidad de diferenciarse. Es decir, para estudiar diferenciación, estamos utilizando un modelo que no se diferencia. Pero resulta que estas células tienen el potencial de diferenciarse cuando las cultivamos con un agente químico. Son varios los agentes químicos que pueden funcionar, aunque los más utilizados son el HMBA y el DMSO. Como estas células son precursoras del sistema eritroide que van a formar glóbulos rojos, aunque están bloqueadas en la diferenciación, si las cultivamos en un medio que tiene alguno de los inductores de diferenciación mencionados, a los 5 días nos encontramos que todas las células se han diferenciado.

Curso "Modificación de la secuencia genética de la línea Parental MEL-DS19. Clase teórica (abril 2019)

Entonces, es un sistema bastante idóneo para preguntarnos: “¿Cuál es la diferencia entre las células iniciales y las que, 5 días después de este tratamiento se han convertido en eritrocitos o glóbulos rojos?”. Y es esto lo que estamos estudiando, a nivel molecular, intentar definir qué genes están activos en cada uno de los procesos.

Ahora bien, una vez identificados qué genes actúan en el tipo diferenciado o en el tipo no diferenciado, la siguiente pregunta sería: “¿qué pasa si eliminamos uno de estos genes?”. Y para eliminar estos genes, “¿qué hacemos?”: utilizamos herramientas CRISPR. Tenemos en este momento una serie de mutantes en donde hemos eliminado uno o varios genes de todo este proceso que creemos son genes determinantes para este proceso de diferenciación.

¿Algo más que quiera agregar?

Me gustaría agregar en este momento, a veces complicado, sobre todo para la comunidad científica, que necesita justificar los temas de investigación y sobre todo, dar un mensaje no solamente para la sociedad en general, sino a los responsables de la financiación para que todos estos proyectos salgan adelante.

El proyecto original de CRISPR presentado por Francis Mojica en el año 93 fue difícil de financiar. El estudio de organismos procariotas, en ese caso arqueas que viven en salinas, no parecía conducir a corto plazo a resultados prometedores especialmente para su aplicación.  Y, sin embargo, el producto final fue una revolución.

Lo que quiero decir con esto es que, nunca sabemos de dónde van a salir los principales descubrimientos. La ciencia, en este sentido, no es programable. Lo fundamental es financiar y apoyar grupos buenos que investiguen de forma rigurosa. Dejar de lado la idea de la aplicabilidad de los resultados a corto plazo que obliga a los investigadores a que adelanten o justifiquen en qué se van a utilizar sus investigaciones. CRISPR es un ejemplo extraordinario de cómo la ciencia se desenvuelve.

Un ejemplo similar fue el que llevo al desarrollo de la tecnología de la “reacción en cadena de la polimerasa” o “PCR”. Este caso que también representó una especie de revolución en el campo de la Biología Molecular en los años 80 se basó en estudios de bacterias que viven a altas temperaturas en aguas termales.

Entonces, considero erróneo que se hable de investigación básica o investigación aplicada; hay que hablar de investigación de calidad y financiar a los buenos grupos. -

Sobre Francis Mujica, ingresar a: 

https://imem.ua.es/es/quienes-somos/francisco-juan-martinez-mojica.html